液体活检领域,测序界“网红”NovaSeq红不起来

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2017年测序行业巨头Illumina推出了“测序洗衣机”型号-NovaSeq,成为了该年度测序行业最大的新闻。NovaSeq系统作为测序界的“网红”,具有可扩展的通量和测序灵活性:2天可产生2TB的数据。

     加入了NovaSeq,Illumina 现有二代测序平台:MiSeq、HiSeq2500(1000G)、HiSeq3000、HiSeq4000、NextSeq500、HiSeqX10 (10台HiSeq2500并行)、HiSeq X Five、NovaSeq5000、NovaSeq6000。

重点!重点!重点!今天这篇文章不是要细数Illumina 现有二代测序平台,而是在液体活检领域HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10以及NovaSeq等二代测序平台的一个“BUG”。

 

     2017年4月份,illumina公布了题为“Effects of Index Misassignment on Multiplexing and Downstream Analysis”的白皮书[1]。坦诚了illumina一些高通量型号,如HiSeq 3000/4000,Hiseq X Series 及NovaSeq等仪器,容易出现样品标签错配(形象的理解为样本带错帽,就像下图的小黄人)的问题,而这些仪器的共同点在于,都采用了新型的以Nano-Well 为特点的Patterned Flow Cell Technology(PFCT),簇生成方式也有别于传统的桥式PCR,换成了ExAmp(Exclusion Amplification,排他性扩增)。Illumina生动的描述这种现象为“标签跳跃”(index hopping)。

      比如在2017年初,美国Standford大学的科研工作者Sinha,利用illumina Hiseq 4000对RNA样本进行测序。结果,本以为自己找到了真正的造血干细胞,但难以重复的实验结果使他发现,那些“激动人心的结果”只不过是在 illumina ExAmp平台的交叉污染产生的“镜花水月”。而相同的文库用Nextseq 500进行测序,那些“激动人心的结果”也再也没来敲门[2]。无独有偶,Cambridge University和Swedish Bioinformatician等研究机构都发现了在Hiseq4000等型号上出现了类似的index标定到错误样品上的问题[2]。

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哪些实验会受标签错配的影响?

       根据研究发现在低频突变检验、基因表达、微生物分析等多方面研究可能会受到标签错配的影响。

       采用NGS检测ctDNA现已成为替代侵入组织活检的“液体活检”,在极低频突变检测中,避免假阳性是液体活检从业者格外关心的重要一环,能够准确的从30亿对碱基中寻找到低频突变,更低的假阳性、更高的敏感度一直是追求的目标。

       而样本串扰发生时,NGS超深度测序优势却被样本错配拖累到不显著了,无法给予准确的后续临床指导用药基因检测结果。因此深究导致标签错配生成的背后原因和如何避免就显得尤为重要。

哪些原因导致标签错配?

       读到这里,大家一定感叹,新技术的出现解决完现有问题,怎么又引入了新的问题。当然,标签错配的“锅”不能只让测序平台来背,接头或引物制备过程中污染、实验室污染,人为操作等、文库构建残留接头或PCR 引物、捕获平台样本多杂一,不完全匹配扩增,以及测序平台等均会导致标签错配。

       而测序平台作为NGS流程的最后一步,在前期环节均保持一致的情况下,还出现标签错配,那这个锅测序平台就必须得背着了。

      让我们再次回归到文章提到的Sinha的例子,在以传统桥式PCR作为簇生成方式的 non-PFCT型测序仪Nextseq 500重新测序后,交叉污染消失了。ExAmp这种技术搭配PFCT使用,大大提升了测序效率,降低了测序成本。但是与传统的桥式扩增相比,也引起了更多的样本错配,HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10以及新贵NovaSeq5000、NovaSeq6000都采用了ExAmp技术,标签跳跃的比例可高达到2%。而液体活检的突变频率要求低至0.1%,而这也导致了在低频突变检测上大大限制了NovaSe,Hiseq X系列等的应用。

       由于测序成本降低,在检测同等基因数的情况下,相比于NextSeq500平台市场价格能够下调较多,多家基因检测公司引入了HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10甚至NovaSeq5000、NovaSeq6000作为二代测序平台,在降低测序成本的同时,要多样本同时检测,必然会造成低频突变交叉污染,导致检测结果“张冠李戴”。

      今天讲了这么多,总结成一句话:在液体活检领域,HiSeq3000、HiSeq4000、HiSeqX10甚至NovaSeq5000、NovaSeq6000作为二代测序平台存在样本突变交叉污染较高,会影响后续基因检测结果,而NextSeq500则表现的非常稳定!

参考文献:

[1] illumina.Effects of index misassignment on multiplexing and downstream[Z] Analysis.

[2]Sinha R, Stanley G, Gulati G S, et al. Indexswitching causes “spreading-of-signal” among multiplexed samples in Illumina HiSeq 4000 DNA sequencing[J]. bioRxiv, 2017: 125724.

来源:癌先生

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